针对上述问题，苏州大学程亮教授、巩飞副教授团队构建了一种新型MIIT引发剂——负载双硫仑（DSF）的ZnCuAl-LDH层状双氢氧化物复合材料，以实现多种金属离子的高效共递送，并增强金属离子在细胞内的滞留能力。在酸性环境中，ZCA-LDH@DSF引发剂能够实现Zn²⁺/Cu²⁺和DSF药物的pH响应性释放。一方面，Cu²⁺与DSF原位结合形成高毒性产物CuET，诱导DNA损伤和细胞凋亡。另一方面，细胞内Cu²⁺超载扰乱三羧酸循环（TCA），导致显著的铜死亡。同时，细胞内Zn²⁺抑制铜转运蛋白ATP7A和ATP7B的表达，减少Cu²⁺外排并促进细胞内Cu²⁺积累，从而进一步放大铜死亡效应。此外，细胞内Zn²⁺还通过caspase-1/消皮素D（GSDMD）依赖途径诱导焦亡，与CuET诱导的细胞凋亡和铜死亡协同作用，显著增强免疫原性细胞死亡（ICD），这有利于肿瘤中的MIIT。因此，ZCA-LDH@DSF展现出诱导MIIT的卓越能力，从而触发多种程序性细胞死亡并抑制肿瘤生长和转移，为抗癌治疗提供了一种新的治疗模式。该文章于2025年12月3日以《A powerful agonist for metal ion interference therapy: Multiple programs of cell death to amplify tumor metalloimmunotherapy》为题发表于《Biomaterials》（DOI：10.1016/j.biomaterials.2025.123888）。

方案1. LDH作为MIIT启动子的示意图：多种程序性细胞死亡方式放大肿瘤金属免疫治疗。（A）通过典型的共沉淀法合成ZCA-LDH，然后负载DSF。（B）ZCA-LDH@DSF诱导多种类型的金属离子干扰介导的细胞死亡（凋亡、铜死亡、焦亡和免疫原性细胞死亡）。

（1）ZCA-LDH@DSF的合成与表征

通过共沉淀法合成ZCA-LDH纳米片，随后负载DSF获得ZCA-LDH@DSF。TEM显示ZCA-LDH呈纳米片结构，DSF负载对其形貌影响甚微（图1B、C）；EDS元素映射证实Zn、Cu、Al、S均匀分布（图1D）；TGA测得DSF负载量约9%（图1H）；水动力直径和表面电荷在负载前后无显著变化（图1E、G）；XRD显示DSF负载后发生轻微蓝移（图1I）；XPS中Cu²⁺/Cu⁺特征峰在DSF负载后显著变化，归因于Cu²⁺配位转化为Cu⁺（图1J）；FT-IR光谱显示ZCA-LDH@DSF与裸DSF特征吸收相似。紫外-可见分光光度法显示DSF负载率在12 h达到饱和（图1L）。ZCA-LDH@DSF在水性介质和1640培养基中孵育14天粒径无显著变化，证实其分散稳定性（图1F）。pH响应释放实验显示，缓冲液中265 nm和425 nm处吸收峰随时间延长逐渐增强，表明CuET累积形成（图1M）；ICP-OES测定显示弱酸性条件下Cu²⁺和Zn²⁺释放速率显著高于中性条件（图1N、O）；酸性缓冲液中ZCA-LDH@DSF快速分解，溶液pH最终趋于中性（图1P）；TEM显示纳米材料结构完全坍塌并产生超小纳米点。

图1. ZCA-LDH@DSF纳米片的合成与表征。(A) ZCA-LDH@DSF纳米片合成过程示意图。(B&C) ZCA-LDH和ZCA-LDH@DSF的透射电镜图像。(D) ZCA-LDH@DSF的元素分布图（Zn、Cu、Al和S）。(E&G) ZCA-LDH和ZCA-LDH@DSF的Zeta电位(E)和水合粒径测量(G)。(F) ZCA-LDH和ZCA-LDH@DSF在RPMI 1640培养基和ddH₂O中放置0天和14天的水合粒径测量。(H) ZCA-LDH和ZCA-LDH@DSF的热重分析结果。(I) ZCA-LDH和ZCA-LDH@DSF的X射线衍射图谱。(J) ZCA-LDH和ZCA-LDH@DSF的Cu 2p X射线光电子能谱。(K) ZCA-LDH和ZCA-LDH@DSF的傅里叶变换红外光谱。(L&M) ZCA-LDH在不同时间的双硫仑负载量和铜离子-双硫仑络合物生成曲线。(N&O) ZCA-LDH@DSF在不同pH缓冲液中的Zn²⁺和Cu²⁺释放曲线。(P) 加入ZCA-LDH@DSF后pH=6.4缓冲液的pH值变化。

（2）体外实验中ZCA -LDH@ DSF 诱导的细胞凋亡

ZCA-LDH在Cu²⁺浓度超过10 μg/mL时仍无明显细胞毒性，DSF单独对CT26细胞活力影响甚微，两者均具良好生物相容性（图2B、C）；而ZCA-LDH@DSF显著降低CT26细胞活力，AM/PI染色显示其死细胞比例最高（图2D、E）。RBH检测显示，ZCA-LDH@DSF孵育后细胞内绿色荧光信号随时间延长而增强，6 h达最大值，表明其被细胞高效内化（图2F）。RNA测序显示ZCA-LDH@DSF组有2539个差异表达基因（1990个上调，549个下调），主成分分析和热图证实其与对照组基因表达谱存在显著差异（图2G、H）；GO分析显示差异基因主要参与细胞周期调控和DNA损伤相关过程（图2I）；KEGG和GSEA分析显示MAPK、p53和TNF等凋亡相关通路显著正富集（图2J、L）。γ-H2AX免疫荧光染色显示CA-LDH@DSF和ZCA-LDH@DSF处理组癌细胞核中均检测到显著信号，表明CuET诱导严重核损伤（图2M）；Annexin V-FITC/PI流式细胞术显示ZCA-LDH@DSF诱导细胞凋亡作用最强（图2N）；细胞周期分析显示ZCA-LDH@DSF处理组出现S期积累，表明其显著诱导细胞周期阻滞（图2K）。

图2. ZCA-LDH@DSF体外诱导细胞毒性与凋亡。（A）ZCA-LDH@DSF诱导凋亡的示意图。（B-D）CT26细胞与DSF、CA-LDH、ZCA-LDH、CA-LDH@DSF或ZCA-LDH@DSF在不同浓度下孵育12 h后的相对活力（均值±标准差，n=5）。（E）经不同处理后AM/PI标记的CT26细胞共聚焦图像，指示细胞活力。（F）通过RBH检测Cu离子显示CT26细胞在不同孵育时间摄取ZCA-LDH@DSF的共聚焦图像。（G）对照组与ZCA-LDH@DSF组差异表达基因的火山图。（H）对照组与ZCA-LDH@DSF组的主成分分析。（I）ZCA-LDH@DSF基因本体富集分析气泡图。（J）ZCA-LDH@DSF凋亡相关KEGG网络图。（K）不同处理组CT26细胞的细胞周期分布分析。（L）ZCA-LDH@DSF组与对照组凋亡通路GSEA富集图。（M）不同处理组PI和Annexin V-FITC染色的CT26细胞流式细胞术分析。（N）γ-H2AX免疫荧光染色显示ZCA-LDH@DSF诱导DNA损伤的共聚焦显微镜图像。

（3）体外实验中 ZCA -LDH@ DSF 诱导的铜死亡

ZCA-LDH@DSF处理后，KEGG分析揭示TCA循环、TNF信号通路、NOD样受体、cAMP信号通路和氧化磷酸化等铜死亡相关通路显著变化（图3B）；铜死亡相关差异表达基因显示Dlat、Pdhb、Cdkn2aip和Gls上调，Mtf1、Dld、Lipt1和Lias下调（图3C）。共聚焦成像和蛋白质印迹显示，CA-LDH@DSF和ZCA-LDH@DSF组FDX1、LIAS水平显著下降，DLAT脂酰化显著增强，其中ZCA-LDH@DSF组DLAT聚集最显著（图3D-F、H、J、K）；WB证实ZCA-LDH@DSF组DLAT聚集增强，表明Zn²⁺对铜死亡具有辅助作用（图3H）。ATP7A/7B蛋白在四个实验组中均显著低于对照组，ZCA-LDH@DSF组表达最低，表明Zn²⁺进一步减少Cu²⁺外排并加剧铜死亡（图3F、H、L）。细胞内Zn²⁺浓度随孵育时间延长而增加，6 h达最大值（图3G）；ZCA-LDH@DSF组Cu²⁺水平显著高于其他组（图3I、M）。铜螯合剂TTM可浓度依赖性地改善ZCA-LDH@DSF组细胞活力，证实铜死亡被显著抑制。

图3. ZCA-LDH@DSF体外诱导铜死亡的评价。（A）ZCA-LDH@DSF诱导铜死亡的示意图。（B）ZCA-LDH@DSF处理后差异表达基因的KEGG通路富集分析。（C）铜死亡通路相关差异表达基因热图，红色方块表示上调基因，蓝色方块表示下调基因。（D、E）不同处理组CT26细胞FDX1和DLAT免疫荧光染色。（F）不同处理组CT26细胞ATP7A免疫荧光染色。（G）ZP-1标记的ZCA-LDH@DSF被CT26细胞在不同孵育时间摄取的共聚焦图像。（H）CT26细胞中ATP7A、ATP7B、LIAS、DLAT和β-actin表达的蛋白质印迹结果。（I）RBH标记的不同处理组CT26细胞共聚焦图像。（J-M）细胞内FDX1、DLAT、ATP7A和RBH荧光强度统计（均值±标准差，n=5）。（N）CT26细胞与ZCA-LDH@DSF及不同浓度TTM（铜死亡抑制剂）孵育12 h后的相对活力（均值±标准差，n=5）。

（4）体外实验中 ZCA -LDH@ DSF 诱导的焦亡

ZCA-LDH@DSF处理后，GSEA显示炎症反应相关通路显著正富集（图4B）；DEGs热图显示线粒体损伤和内质网应激相关基因显著变化（图4C）。Annexin V-FITC/PI共染色显示，ZCA-LDH@DSF组CT26细胞显著肿胀并产生大气泡，PI红色荧光明显，细胞膜完整性被破坏，且焦亡细胞显著多于CA-LDH@DSF组（图4D、F）。WB显示ZCA-LDH@DSF组caspase-1活化切割增加，GSDMD被切割后GSDMD-N表达升高（图4E）。共聚焦成像显示ZCA-LDH@DSF组CRT聚集显著、HMGB1下调（图4H、I），与其他组存在差异（图4J、K）；WB证实上述现象（图4L）。ZCA-LDH@DSF组ATP分泌水平显著高于对照组（图4G）。凋亡、铜死亡和焦亡三种程序性细胞死亡整合于ZCA-LDH@DSF中，产生显著ICD效应（图4M）。

图4. ZCA-LDH@DSF体外诱导焦亡和免疫原性细胞死亡（ICD）的评价。（A）ZCA-LDH@DSF诱导焦亡的示意图。（B）ZCA-LDH@DSF组与对照组炎症反应通路GSEA富集图。（C）线粒体损伤、内质网应激和炎症小体组装相关基因热图，红色方块表示上调基因，蓝色方块表示下调基因。（D）不同处理后Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）染色的CT26细胞共聚焦图像。（E）CT26细胞中GSDMD、Caspase-1、GSDMD-N、cleaved Caspase-1和β-actin表达的蛋白质印迹结果。（F）不同处理后CT26细胞焦亡比例（均值±标准差，n=5）。（G）不同处理组细胞培养基中ATP释放水平（均值±标准差，n=5）。（H、I）不同处理后CT26细胞CRT和HMGB1免疫荧光染色。（J、K）细胞内CRT和核内HMGB1荧光强度统计（均值±标准差，n=5）。（L）CT26细胞中CRT、HMGB1和β-actin表达的蛋白质印迹结果。（M）ZCA-LDH@DSF诱导ICD的示意图，有利于T细胞激活和抗肿瘤免疫应答。

（5）ZCA-LDH@DSF NSs的体内抗肿瘤效果

肿瘤接种7天后，荷瘤小鼠随机分为5组（n=5）：对照组、CA-LDH组（2.5 mg/kg）、ZCA-LDH组（2.5 mg/kg）、CA-LDH@DSF组（2.5 mg/kg + 5 mg/kg DSF）和ZCA-LDH@DSF组（2.5 mg/kg + 5 mg/kg DSF），于第0、2、4天接受三次治疗（图5A）。CA-LDH和ZCA-LDH部分抑制肿瘤生长，CA-LDH@DSF和ZCA-LDH@DSF具有显著肿瘤抑制效果，其中ZCA-LDH@DSF治疗效果最强并显著延长生存时间（图5B、C）；治疗期间小鼠体重保持稳定（图5D）。H&E染色显示ZCA-LDH@DSF组肿瘤组织呈现显著病理损伤，包括核溶解、碎裂和淋巴细胞浸润（图5E）；Ki67荧光染色显示该组肿瘤细胞增殖显著减少（图5F、G）。ICP-OES显示ZCA-LDH@DSF在肿瘤中滞留超过两周（图5H）。免疫荧光染色显示ZCA-LDH@DSF组ATP7A/7B表达显著降低，DLAT和N-GSDMD表达明显增加（图5I-N）；CRT高表达和HMGB1释放证实其诱导强效ICD（图5J、O、P）。

图5. ZCA-LDH@DSF体内抗肿瘤效应。（A）ZCA-LDH@DSF治疗CT26皮下肿瘤模型流程示意图。（B）不同处理后小鼠平均肿瘤生长曲线。（C）不同处理后小鼠60天监测期生存率曲线。（D）治疗期间小鼠体重变化。（E、F）不同处理后肿瘤组织切片H&E和Ki67染色。（G）Ki67表达荧光强度统计（均值±标准差，n=5）。（H）瘤内注射后通过ICP-OES检测Zn²⁺和Cu²⁺以评估ZCA-LDH@DSF在肿瘤内的滞留。（I、J）肿瘤切片荧光图像，用于评估ATP7A、ATP7B、DLAT、N-GSDMD、CRT和HMGB1表达。（K-P）ATP7A、ATP7B、DLAT、N-GSDMD、CRT和HMGB1荧光强度统计，揭示体内多重细胞死亡现象（均值±标准差，n=5）。

（6）体内免疫应答与联合免疫治

ZCA-LDH@DSF治疗后，淋巴结中DC成熟显著增加（图6E）；肿瘤内Tregs数量显著减少（图6B），总淋巴细胞、NKT细胞和辅助性T细胞等效应免疫细胞数量显著增加（图6C、D、G-J）；组织学染色显示大量免疫细胞被招募至肿瘤（图6K、L）；M1巨噬细胞侵入频率显著增加，M2巨噬细胞被抑制（图6F）。

在双侧荷瘤小鼠模型中，小鼠随机分为4组（n=5）：对照组、αPD-L1组（20 μg/只，静脉注射）、ZCA-LDH@DSF组（2.5 mg/kg，瘤内注射）和联合组。ZCA-LDH@DSF于第0、2、4天瘤内注射，αPD-L1于第1、3、5天静脉注射（图6M）。与原发肿瘤相比，ZCA-LDH@DSF组和联合组肿瘤增殖受抑，联合组抑制效果最显著（图6N）；联合组远端肿瘤生长远优于其他三组（图6Q）。免疫荧光显示联合组双侧肿瘤中CTL浸润显著增加，αPD-L1表达显著降低（图6O、R）。ZCA-LDH@DSF诱导多种程序性细胞死亡触发T细胞介导的抗肿瘤免疫，与免疫检查点抑制剂联合有效抑制肿瘤生长和转移（图6P）。

图6. ZCA-LDH@DSF诱导的体内免疫应答及与αPD-L1联合的抗肿瘤效应。（A）免疫评价流程示意图。（B-D）不同处理后肿瘤内Tregs（B）、T细胞（C）和CD4⁺ T细胞（D）的流式细胞术分析。（E-J）不同处理后肿瘤内成熟DC、M1巨噬细胞、NK细胞、T细胞、CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞的定量分析（均值±标准差，n=5）。（K、L）不同组CD4⁺和CD8⁺ T细胞的免疫荧光染色。（M）ZCA-LDH@DSF联合αPD-L1治疗双侧CT26皮下肿瘤小鼠流程示意图。（N）不同处理后原发肿瘤平均及个体生长曲线（G1：对照组；G2：αPD-L1；G3：ZCA-LDH@DSF；G4：ZCA-LDH@DSF + αPD-L1）（均值±标准差，n=5，p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001）。（O）不同组原发肿瘤中CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和PD-L1表达的免疫荧光染色图像。（P）ZCA-LDH@DSF联合αPD-L1激活免疫系统的示意图。（Q）不同处理后远端肿瘤平均及个体生长曲线。（R）不同组远端肿瘤中CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和PD-L1表达的免疫荧光图像。