针对上述问题，同济大学苏剑生团队构建了一种仿细胞器纳米治疗平台（GA@LDs-CRAMP），用于多靶点干预牙周炎。研究团队从脂多糖（LPS）激活的RAW264.7巨噬细胞中分离提取脂滴（LDs），通过在其疏水核心包载藤黄酸（GA）并在表面锚定小鼠抗菌肽CRAMP进行双功能化改造。在小鼠结扎诱导的牙周炎模型中，该纳米平台显著缓解炎症反应并减少牙槽骨吸收，为炎症性疾病的下一代纳米药物研发提供了新范式。该文章于2026年1月14日以《Bioinspired lipid droplets nanoplatform for periodontitis therapy: Integrated antibacterial, mitochondrial repair, and immunomodulatory functions》为题发表于《Materials Today Bio》（DOI：10.1016/j.mtbio.2026.102808)。

图1 GA@LDs-CRAMP的制备及其促进牙周组织修复的作用模式示意图

（1）GA@LDs-CRAMP纳米平台的构建与表征

油酸诱导脂滴生物发生后，GA以0.5 μM（细胞存活率>90%）被动包载于中性脂质核心，Cy5.5标记证实其与脂滴显著共定位，4小时高效包载且24小时效率稳定（图2A-C）。脂多糖（1 μg/mL，18小时）协同增强脂滴生物发生，上调脂滴数量、尺寸及PLIN2 mRNA表达（图2D-F）；免疫荧光显示脂多糖激活的RAW264.7细胞中CRAMP定位于脂滴表面，未刺激组信号可忽略（图2G）。高速离心分离后Western blot证实脂滴表面存在PLIN2和CRAMP，且CRAMP表达与脂多糖浓度及脂滴数量呈线性相关（图2H-I）。GA@LDs-CRAMP分离形成特征性白色中间层，冻干后水分散性良好（图2K），透射电镜显示结构完整、呈单分散球形，平均粒径分别为327.3 ± 23.9 nm和172.9 ± 5.1 nm，Zeta电位分别为−41.9 ± 1.3 mV和−39.6 ± 3.8 mV（图2L-M）。紫外-可见光谱360 nm特征峰证实GA保留（图2N），pH 5.5条件下24–72小时持续释放GA（图2O），72小时内CRAMP蛋白表达稳定（图2P-Q）。细胞内合成过程中脂滴数量增加而尺寸无显著变化（图2R），在PBS和10% FBS-DMEM中72小时粒径变化可忽略（图2S）。

图2 GA@LDs-CRAMP的构建与表征。（a）GA包载于RAW264.7脂滴的示意图；（b）GA细胞毒性（n=5）；（c）Cy5.5-GA与脂滴共定位共聚焦图像，标尺：10 μm；（d）脂多糖浓度/时间依赖性脂滴生物发生荧光图像，标尺：10 μm；（e-f）脂多糖浓度/时间依赖性脂滴数量、尺寸及PLIN2 mRNA的qRT-PCR定量；（g）CRAMP与脂滴共定位免疫荧光图像，标尺：5 μm；（h-i）PLIN2和CRAMP的Western blot验证，CRAMP表达与脂多糖浓度及脂滴数量呈线性相关；（j）GA@LDs-CRAMP合成流程图；（k）离心分层、冻干粉及水分散液图像；（l）透射电镜图像，标尺：100 nm；（m）粒径分布；（o）pH 5.5下GA释放曲线；（p-q）CRAMP表达稳定性Western blot及定量（n=3）；（r）合成过程脂滴数量与尺寸变化（n=20）；（s）PBS和10% FBS-DMEM中72小时稳定性（n=5）。ns>0.05，p<<0.05，p<<0.01，p<<0.001，****p<<0.0001。

（2）双功能脂滴的抗菌与线粒体靶向递送作用

LDs-CRAMP对牙周炎相关致病菌伴放线聚集杆菌和牙龈卟啉单胞菌的生长具有显著抑制作用，平板培养菌落形成单位明显减少（图3A、Ba），液体悬浮液OD600值显著降低（图3Bb）；GA@LDs-CRAMP的抗菌活性受合成过程中脂多糖浓度和脂滴数量影响（图3C、D），且在体外储存72小时内不同时间点均表现出稳定的抗菌活性（图3E、F）。细胞毒性评估显示，GA@LDs-CRAMP在浓度≤250 nM时对小鼠牙龈成纤维细胞无明显毒性（图3Ga），在浓度达500 nM时仍保持骨髓源性巨噬细胞存活率大于90%（图3Gb）。GA@LDs-CRAMP可在12小时内实现快速细胞摄取（图3H）。共聚焦成像显示GA@LDs-CRAMP主要定位于线粒体附近，具有线粒体靶向药物递送能力（图3I、J）。

图3 脂滴基纳米平台的抗菌与线粒体靶向功能。（a）各组样品孵育16小时后伴放线聚集杆菌和牙龈卟啉单胞菌的菌落形成单位；（b）相对菌落形成单位及相对OD600（n=5）；（c）不同浓度脂多糖制备的GA@LDs-CRAMP点板实验（n=3）；（d）点板菌落计数（n=3）；（e）不同储存时间GA@LDs-CRAMP点板实验（n=3）；（f）储存时间依赖性抗菌活性稳定性（n=3）；（g）GA@LDs-CRAMP浓度依赖性细胞活力；（h）Cy5.5-GA@LDs-CRAMP内化的延时共聚焦图像，标尺：20 μm；（i）Cy5.5-GA@LDs-CRAMP与线粒体、溶酶体、内质网的亚细胞分布，标尺：20 μm（主图）、10 μm（放大图）；（j）皮尔逊共定位系数（n=5）。ns>0.05，p<<0.05，p<<0.01，p<<0.001，****p<<0.0001。

（3）GA@LDs-CRAMP对氧化应激下线粒体功能的修复作用

DCFH-DA荧光探针检测显示GA@LDs-CRAMP有效缓解H2O2诱导的小鼠牙龈成纤维细胞活性氧过量产生（图4A、B）。JC-1染色显示H2O2诱导的线粒体膜电位降低与糖酵解上调相关，GA@LDs-CRAMP处理显著增强红色荧光强度，促进线粒体网络完整性部分恢复，并提高聚集体/单体比值，证实线粒体膜电位恢复（图4C、D）。MitoTracker-Red染色显示H2O2处理的小鼠牙龈成纤维细胞出现严重线粒体碎裂、核周聚集和细胞质分布紊乱，GA@LDs-CRAMP处理可逆转这些病理特征，恢复管状线粒体形态和均匀细胞质分布，其结构修复效果优于游离GA（图4E、G）。CCK-8实验显示GA@LDs-CRAMP预处理可挽救H2O2诱导的细胞毒性，提高细胞存活率（图4F）。RNA测序分析显示GA@LDs-CRAMP处理诱导3312个基因上调和4998个基因下调（图4I），显著上调线粒体复合体I亚基和电子传递链细胞色素相关基因表达；KEGG通路分析鉴定出氧化磷酸化和糖酵解信号通路显著富集（图4H），基因集富集分析显示电子传递链相关和氧化磷酸化相关基因集显著上调（图4J）。qRT-PCR初步验证显示GA@LDs-CRAMP显著上调H2O2诱导氧化应激损伤下调的mt-Nd1、mt-Nd2、mt-Co2、mt-Cytb和mt-Atp6基因表达水平（图4L）。

图4 GA@LDs-CRAMP修复线粒体功能缓解氧化应激。（a）DCFH-DA检测细胞内活性氧荧光图像，标尺：5 μm；（b）荧光强度定量（n=5）；（c）JC-1染色检测线粒体膜电位，标尺：2 μm；（d）JC-1聚集体/单体比值（n=5）；（e）线粒体形态与空间分布，标尺：1 μm；（f）GA@LDs-CRAMP预处理后H2O2暴露细胞活力（n=5）；（g）线粒体形态定量：体积、面积、分支数、球形度（n=20）；（h）线粒体相关基因KEGG富集分析；（i）差异表达基因火山图；（j）氧化磷酸化和电子传递链通路上调的GSEA分析；（k）线粒体修复与活性氧清除机制示意图；（l）线粒体功能基因mRNA表达的qRT-PCR定量（n=3）。ns>0.05，p<<0.05，p<<0.01，p<<0.001，****p<<0.0001。

（4）GA@LDs-CRAMP通过双重调控Nrf2/NF-κB信号通路及巨噬细胞M2极化促进炎症消退

GA@LDs-CRAMP预处理显著抑制脂多糖刺激的骨髓源性巨噬细胞中NF-κB介导的Il6和肿瘤坏死因子-α转录激活，下调M1标志物诱导型一氧化氮合酶，上调M2标志物精氨酸酶1及抗炎细胞因子Il10（图5Aa-e）。酶联免疫吸附实验证实其显著降低IL-6并升高IL-10水平，效果优于游离GA（图5Ba-b）。流式细胞术显示其减少CD86标记M1型巨噬细胞并促进CD206标记M2型极化（图5C-D）。RNA测序鉴定出1377个上调基因和1892个下调基因（图5E），KEGG分析确定NF-κB信号通路为最显著改变通路，涉及肿瘤坏死因子、趋化因子、IL-17、MAPK等炎症级联及糖酵解、精氨酸-脯氨酸代谢等代谢通路（图5F）；精氨酸酶1为最显著上调基因，IL-6和诱导型一氧化氮合酶为最显著下调转录本（图5G）。层次聚类显示促炎介质、趋化因子和骨溶解基因协调下调，组织修复介质上调（图5H）；GSEA证实其抑制炎症和氧化应激相关通路（图5I）。免疫荧光显示GA@LDs-CRAMP驱动Nrf2从细胞质向细胞核转位，核荧光强度及皮尔逊共定位系数显著高于GA组和LDs-CRAMP组（图6A-B）。Western blot验证其显著降低IL-6和诱导型一氧化氮合酶，上调精氨酸酶1（图6C），通过减弱磷酸化NF-κB p65和抑制IκBα磷酸化抑制NF-κB通路（图6D），促进Nrf2核积累并降低细胞质Keap1，触发血红素加氧酶-1和NQO1显著上调（图6E）。

图5 GA@LDs-CRAMP在骨髓源性巨噬细胞中的抗炎活性及极化调控能力验证。（a）炎症细胞因子（Il6、Tnf）、巨噬细胞极化标志物（Nos2、Arg1）和抗炎细胞因子（Il10）的qRT-PCR定量分析（n=3）；（b）ELISA定量检测培养上清中炎症细胞因子IL-6（a）和抗炎细胞因子IL-10（b）（n=5）；（c）F4/80标记骨髓源性巨噬细胞极化的流式细胞术分析，CD86为M1型标志物，CD206为M2型标志物；（d）各组细胞CD86（a）和CD206（b）荧光强度定量统计（n=3）；（e）GA@LDs-CRAMP组与脂多糖处理组差异表达基因火山图（|log2FC|>1.2，FDR<0.05）；（f）差异表达基因KEGG通路富集分析（前20条感兴趣通路）；（g）富集KEGG术语的基因-通路关联弦图；（h）感兴趣富集基因热图；（i）基因集富集分析显示（a）细胞因子和炎症反应、（b）氧化应激和氧化还原调节、（c）氧化应激反应、（d）三羧酸循环、（e）线粒体基因表达、（f）氧化磷酸化通路的富集。ns>0.05，p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001。

图6 GA@LDs-CRAMP在骨髓源性巨噬细胞中的抗炎及抗氧化机制。（a）脂多糖刺激骨髓源性巨噬细胞中Nrf2（红色）与细胞核（蓝色）的免疫荧光图像，标尺：10 μm；（b）Nrf2红色荧光与DAPI染色核蓝色荧光的皮尔逊共定位系数定量分析（n=5）；（c）巨噬细胞极化标志物（iNOS、Arg1）和炎症细胞因子（IL-6）的Western blot验证及半定量分析；（d）NF-κB通路组分（p65、p-p65、IκBα、p-IκBα）相对表达的Western blot验证及半定量分析（n=3）；（e）Nrf2通路组分（Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1）相对表达的Western blot验证及半定量分析（n=3）。ns>0.05，p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001。

（5）GA@LDs-CRAMP在小鼠实验性牙周炎中的综合治疗效果

7天上颌第二磨牙结扎法诱导牙周炎后，每3天局部注射GA@LDs-CRAMP、LDs-CRAMP或游离GA，共5次，治疗周期15天（图7A）。显微CT显示牙周炎组釉牙骨质界至牙槽骨嵴距离显著增加，GA@LDs-CRAMP显著恢复牙槽骨高度，降低釉牙骨质界-颊侧和釉牙骨质界-腭侧距离，疗效优于LDs-CRAMP和游离GA（图7B-Ca、b）；二维放射重建显示病理性骨吸收减轻（图7B）。骨小梁定量分析证实GA@LDs-CRAMP逆转骨体积分数、骨密度和骨小梁数量降低，恢复骨小梁分离度（图7C）。苏木精-伊红染色显示GA@LDs-CRAMP逆转牙周炎引起的上皮下炎症浸润、牙槽骨丢失和胶原基质降解（图7D）；马松三色染色显示其恢复胶原结构完整性（图7E）。免疫组化显示GA@LDs-CRAMP减弱IL-6表达（图8A-B），增强精氨酸酶1表达并抑制诱导型一氧化氮合酶（图8C-F）。免疫荧光显示其减少CD86标记M1型巨噬细胞数量，低于LDs-CRAMP和GA组（图9A-B）；增加CD206标记M2型巨噬细胞数量，高于LDs-CRAMP和GA组（图9C-D）。

图7 GA@LDs-CRAMP在实验性牙周炎中的治疗效果。（a）牙周炎诱导（结扎模型）及治疗干预时间线示意图；（b）上颌牙槽骨三维重建显微CT图像（颊侧/腭侧视图）及横截面放射影像，标尺：1 mm；（c）釉牙骨质界至牙槽骨嵴距离及骨体积分数、骨密度、骨小梁数量与分离度等骨微结构参数的定量分析（n=12）；（d）牙周组织苏木精-伊红染色；（e）牙周组织马松三色染色，标尺：200 μm（主图）、50 μm（放大图）。ns>0.05，p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001。

图8 牙周组织的免疫组化分析。（a）IL-6免疫组化染色代表性图像及半定量分析；（b）Arg1免疫组化染色代表性图像及半定量分析；（c）iNOS免疫组化染色代表性图像及半定量分析（n=5），标尺：200 μm（主图）、50 μm（放大图）。ns>0.05，p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001。

图9 牙周组织的免疫荧光分析。（a）牙周组织中F4/80（绿色）和CD86（红色）免疫荧光染色代表性图像，标尺：100 μm（主图）、25 μm（放大图）；（b）CD86+F4/80+双阳性细胞占F4/80+单阳性细胞百分比的定量分析（n=5）；（c）牙周组织中F4/80（绿色）和CD206（红色）免疫荧光染色代表性图像，标尺：100 μm（主图）、25 μm（放大图）；（d）CD206+F4/80+双阳性细胞占F4/80+单阳性细胞百分比的定量分析（n=5）。ns>0.05，p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001。