针对上述问题，安徽医科大学王咸文教授团队联合苏州大学刘庄教授团队通过配位自组装方法合成了一种铜-头孢唑林纳米抗生素（Cu-CZO），用于对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染。Cu-CZO结合了CZO的抗菌活性与过氧化物酶（POD）样酶活性，通过下调CopA转运蛋白执行反向特洛伊木马策略，从而介导Cu-CZO的胞内积累，规避外排介导的抗菌耐药性（AMR），实现卓越的杀菌效果。该文章于2026年4月10日以《Nanoantibiotic copper-cefazolin combats MRSA infection through a reverse Trojan horse strategy》为题发表于《Cell Press Blue》（DOI: 10.1016/j.cpblue.2026.100013）。

方案1. Cu-CZO通过下调CopA并采用反向特洛伊木马策略对抗MRSA感染的示意图

（1）Cu-CZO的形貌与表征

Cu-CZO通过室温中性水溶液一步组装合成，TEM显示其为分散良好的球形纳米颗粒（平均直径约10 nm），Zeta电位为−3.8 mV，具有良好的稳定性。FTIR光谱在1,180、1,240和1,680 cm⁻¹处的吸收带分别归属于CZO中C–O、C–C和C=N的伸缩振动；ICP-MS证实了Cu²⁺与CZO的成功结合；XRD显示其为含CZO的无定形结构；XPS揭示了Cu、O、N、C和S的元素组成及化学态，其中Cu²⁺在933和953 eV处的特征峰以及O 1s（532 eV，Cu-O）和S 2p（162 eV，Cu-S）信号证实了配位键的形成。Cu-CZO在水溶液中72小时后Zeta电位保持稳定，且铜离子在pH 7.2时释放率仅为0.76%，证明其在生理条件下具有优异的稳定性。为验证其氧化酶样活性，以OPD和TMB为底物进行测定，结果显示Cu-CZO在酸性环境中可催化H₂O₂产生ROS，形成稳定的类芬顿反应，吸光度呈剂量依赖性增加，表明其具有良好的抗菌和抗生物膜潜力。此外，以DPPH⋅和ABTS⋅⁺为底物测试其自由基清除能力，结果显示Cu-CZO能够以剂量依赖方式清除自由基，具有良好的抗氧化能力，可有效抑制ROS诱导的炎症反应，在伤口修复中具有抗炎潜力。

图1. Cu-CZO的表征。a）Cu-CZO合成示意图；b）CZO、CuCl₂和Cu-CZO溶液的照片；c）高分辨TEM图像；d）CZO、CuCl₂和Cu-CZO的Zeta电位；e）CuCl₂、CZO和Cu-CZO的FTIR光谱；f–i）Cu-CZO的高分辨XPS光谱（f）、Cu 2p（g）、O 1s（h）和S 2p（i）；j–l）不同组（j）、不同Cu-CZO浓度（k）和不同H₂O₂浓度（l）中OPD的吸光度；m–o）不同组（m）、不同Cu-CZO浓度（n）和不同H₂O₂浓度（o）中TMB的吸光度；p和q）不同浓度Cu-CZO处理下DPPH和ABTS溶液的吸光度。

（2）Cu-CZO的体外抗菌性能

鉴于伤口感染严重损害愈合并可能导致全身并发症，研究团队评估了Cu-CZO对MRSA的疗效。体外实验证实其强大的抗菌活性：低浓度H₂O₂（100 μM）单独处理对细菌无显著影响，但含Cu-CZO的培养基中MRSA菌落形成单位（CFU）随浓度增加而显著减少，2 μM时生长抑制率高达99.5%，且Cu-CZO和Cu-CZO + H₂O₂的抗菌活性均强于CZO，这可归因于其在酸性微环境中的POD样催化活性——催化内源性H₂O₂转化为ROS实现高效杀菌。PI染色及流式细胞术显示Cu-CZO + H₂O₂组受损细菌比例高达44.3%，细菌死活染料染色及激光共聚焦显微镜显示该组红色荧光显著增强、绿色荧光减弱，SEM观察到MRSA细胞壁和细胞膜结构被强烈破坏，BCA定量显示上清液蛋白含量高达344.5 μg/mL，证实细胞膜破裂导致胞内蛋白泄漏。然而，Cu-CZO对大肠杆菌和铜绿假单胞菌抗菌活性可忽略，表明其对MRSA具有特异性，最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）分别仅为1和2 μM。此外，相同剂量下Cu²⁺本身不表现抗菌活性，表明Cu-CZO的强大活性并非直接来源于Cu²⁺。

图2. Cu-CZO的体外抗菌活性。a）显示Cu-CZO在琼脂平板上抗菌活性的照片；b）Cu-CZO孵育后细菌存活率；c）MRSA与培养基（对照）、H₂O₂、CZO、Cu-CZO或Cu-CZO + H₂O₂孵育后的流式细胞术结果；d）MRSA与CZO、Cu-CZO和Cu-CZO + H₂O₂孵育后的生长曲线；e）不同浓度Cu-CZO + H₂O₂处理的MRSA生长曲线；f）不同处理后MRSA的N01/PI染色结果及相应琼脂平板抗菌活性照片；g）不同处理后MRSA的SEM图像；红色箭头表示受损细菌。

（3）Cu-CZO破坏成熟生物膜

生物膜是由多糖、蛋白质、eDNA等胞外聚合物（EPS）包裹的微生物群落，其致密结构和酸性、富H₂O₂微环境可保护细菌免受抗生素及免疫攻击，加剧伤口愈合难度。研究团队评估了Cu-CZO根除MRSA生物膜感染的有效性。结晶紫染色及倒置显微镜显示，Cu-CZO或Cu-CZO + H₂O₂处理后生物膜显著变薄，2 μM时Cu-CZO + H₂O₂组残留生物量可忽略，590 nm处吸光度最低；CLSM观察显示该组生物膜荧光强度大幅减弱，生物膜量减少至23.7%，这归因于Cu-CZO在酸性微环境中的POD样酶活性催化H₂O₂产生大量ROS，使生物膜结构松散、保护屏障被破坏；SEM图像亦证实类似破坏效果。相比之下，单独使用H₂O₂、CZO或Cu-CZO的破坏效果有限，证明了Cu-CZO与H₂O₂的协同生物膜破坏效应。这些数据表明Cu-CZO通过增强H₂O₂衍生的ROS产生以降解成熟MRSA生物膜，为对抗生物膜相关感染提供了有前景的策略。

图3. Cu-CZO对MRSA生物膜的清除效果。a）Cu-CZO破坏生物膜的示意图；b）结晶紫染色后不同浓度Cu-CZO（0–2 μM）抑制MRSA的照片及相应定量吸光度；c和d）不同处理后N01标记的MRSA生物膜3D CLSM图像及相应荧光定量；e）不同处理后生物膜中ROS的CLSM图像；f）不同处理后MRSA生物膜的代表性SEM图像。

（4）Cu-CZO下调细菌Cu²⁺转运蛋白CopA

铜（Cu）是必需微量元素，胞内Cu²⁺水平需严格调控以维持铜稳态。在金黄色葡萄球菌中，铜敏感操纵子（cso）的ctpV基因编码外排泵CopA以排出过量Cu²⁺，而阻遏蛋白CsoR与cso启动子结合维持稳态。Cu-CZO引起CsoR上调，抑制ctpV转录，减少CopA蛋白翻译，下调细胞膜上CopA外排泵，增加Cu²⁺胞内富集并破坏铜代谢；同时CZO存在使Cu²⁺富集间接导致CZO在菌内滞留，减少外排，最终在Cu²⁺与CZO联合作用下导致细胞死亡。转录组学分析显示，与对照组相比Cu-CZO + H₂O₂处理上调137个、下调177个基因；与CZO组相比则上调245个、下调263个基因。GO富集分析表明铜离子响应和应激响应通路高度富集，热图和弦图进一步揭示了相关基因网络关系。上述结果共同表明，Cu-CZO流入细菌后介导CsoR上调、ctpV下调，CopA难以维持Cu²⁺稳态，胞内Cu²⁺增加且铜代谢紊乱，同时CZO作用时间延长，在铜毒性与CZO双重作用下杀死细菌。

图4. 经不同处理后MRSA的RNA-seq转录分析。a–c）差异表达基因的火山图；d和e）上调基因的GO富集；f）经培养基、CZO或Cu-CZO + H₂O₂处理的细胞中基因表达的热图；g）Cu-CZO诱导细菌内Cu²⁺富集的示意图；h）揭示各处理组中转录基因数量的韦恩图。

（5）Cu-CZO在细菌内的富集

为进一步证明Cu²⁺在细菌内部富集，使用生物透射电子显微镜（Bio-TEM）观察细菌内部结构，经Cu-CZO + H₂O₂处理后检测到细菌内部存在大量Cu-CZO。随后通过能量色散光谱（EDS）mapping展示Cu-CZO在细菌内的富集情况——Cu-CZO + H₂O₂处理的MRSA含有1.68%的元素Cu，而对照MRSA仅含0.61%的元素Cu。通过ICP-MS测定细菌内元素铜含量，对照组和CZO组含铜量相似（分别为0.37和0.36 μg/mL），而Cu-CZO + H₂O₂组细菌内含铜量为0.89 μg/mL。两个生物学过程均对应cso相关通路。使用qPCR进一步验证cso中包含的基因表达，cso相关基因表达发生变化，证实了前述Cu²⁺富集通路。综上所述，Cu-CZO可下调细菌Cu²⁺转运蛋白CopA，导致细菌铜代谢破坏，克服细菌对抗生素的外排耐药通路，最终杀死细菌。

图5. Cu-CZO在MRSA中的富集。a）MRSA的代表性Bio-TEM显微照片；b）不同处理后MRSA中S和Cu的明场及EDS mapping；c和d）显示代表性基因表达水平的qPCR结果。

（6）Cu-CZO促进细胞迁移和管腔形成

除应对细菌感染外，细胞迁移、胶原沉积和血管网络重塑对伤口修复的愈合效果至关重要。在伤口愈合方面，Cu²⁺是多种酶、蛋白质和转录因子（如血管内皮生长因子VEGF和TGF-β）的催化剂，在伤口修复领域具有重要生物学功能。为更直观地观察Cu-CZO对细胞迁移率的调控，使用Transwell细胞迁移实验和细胞划痕实验进行验证，结果显示Cu-CZO显著增加细胞迁移率。细胞管腔形成实验显示Cu-CZO显著促进血管网络重塑。通过琼脂糖凝胶电泳培养不同条件下的L929细胞并提取细胞蛋白，结果显示Cu-CZO促进细胞胶原（I型胶原）沉积和VEGF上调。上述结果表明Cu-CZO促进细胞增殖、迁移和血管生成，其作用机制在蛋白水平得到验证，提示Cu-CZO具有促进伤口修复的潜力。

图6. Cu-CZO修复促进能力的体外评估。a和d）培养于Transwell板的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）典型图像（a）及迁移细胞数量的相应定量分析（d）；b和e）L929细胞在补充PBS、CZO或Cu-CZO的培养基中生长的划痕显微照片（b）及相应定量直方图（e）；c）对照、CZO或Cu-CZO处理的HUVECs管腔形成实验图像；f）HUVECs体外管腔形成结果的相应定量分析；g–i）不同处理后不同蛋白表达的代表性Western blot结果（g）及Western blot结果的相应定量分析（h和i）。

（7）Cu-CZO清除MRSA感染的皮下脓肿

Cu-CZO强大的体外抗菌活性促使研究团队评估其在小鼠MRSA皮下脓肿模型中的疗效。第0天将荧光标记的MRSA悬液（1×10⁷ CFU/mL）皮下注射至小鼠体内建立模型，第1天随机分为对照组、H₂O₂组、CZO组、Cu-CZO组和Cu-CZO + H₂O₂组并给予相应处理，随后在第1、2和4天拍摄脓肿照片并进行小动物体内荧光成像。结果显示，治疗后第2天仅Cu-CZO + H₂O₂组皮肤保持完整，第4天该组脓肿基本消除，琼脂平板计数和荧光成像均证实其菌落数量显著低于其余四组且荧光强度可忽略；对照组和H₂O₂组荧光趋于扩散，表明未能抑制脓肿生长，而Cu-CZO和Cu-CZO + H₂O₂均有效抑制，后者效果最显著。H&E染色显示Cu-CZO + H₂O₂组表皮完整性高，其余四组表皮不完整甚至广泛溃疡；Masson三色染色显示该组角蛋白积累更多，在确保表皮完整性的同时恢复了上皮细胞屏障功能。这些结果表明Cu-CZO + H₂O₂可有效清除MRSA感染引起的皮下脓肿并显著促进皮肤修复。

图7. Cu-CZO在体内清除MRSA感染的皮下脓肿。a）Cu-CZO处理MRSA感染皮下脓肿模型小鼠的示意图；b）不同处理4天内MRSA感染脓肿的愈合效果及相应琼脂平板抗菌活性照片；c）各处理组皮肤组织的活体成像；d和e）第4天H&E和Masson三色染色的皮肤组织切片典型图像。

（8）Cu-CZO促进急性感染伤口愈合

为进一步验证Cu-CZO的体内抗菌效应和促进愈合能力，研究团队建立了MRSA感染急性伤口模型，小鼠于第1天和第3天分别接受生理盐水、100 μM H₂O₂、CZO、Cu-CZO或Cu-CZO + H₂O₂处理，监测愈合至第10天并采集样本分析。结果显示，第3天Cu-CZO组和Cu-CZO + H₂O₂组愈合率显著高于其余三组，该差异维持至第10天，其中Cu-CZO + H₂O₂组愈合率高达92.9%，显著高于生理盐水组（62.7%）和CZO组（68.3%）。H&E和Masson三色染色显示，第10天Cu-CZO + H₂O₂组表皮分裂良好、厚度恢复正常，且显著促进毛囊新生和血管重塑；皮下胶原沉积和细胞分化明显，成纤维细胞增殖且胶原排列整齐，表明更好的治疗效果。免疫荧光显示Cu-CZO组和Cu-CZO + H₂O₂组NF-κB和TNF-α表达显著低于其他三组，表明其显著抑制后期炎症反应，与及时清除炎症、避免慢性伤口形成的临床需求一致。这些结果证实Cu-CZO + H₂O₂可有效促进MRSA感染伤口愈合。

图8. Cu-CZO加速体内MRSA感染伤口的愈合。a）Cu-CZO处理MRSA感染小鼠的示意图；b和c）不同处理后MRSA感染伤口的照片（b）及相应伤口闭合率（c）；d和e）第10天H&E和Masson三色染色的皮肤组织切片典型图像；f）不同处理后伤口组织中NF-κB和TNF-α的免疫荧光染色。

（9）Cu-CZO抑制炎症反应并促进皮肤功能恢复

为深入了解Cu-CZO在急性感染伤口愈合中的作用机制，研究团队对对照组、CZO组和Cu-CZO + H₂O₂组进行转录组测序。结果显示，与对照组相比，Cu-CZO + H₂O₂显著下调IL-1β、IL-17、IL-18、TNF-α和NF-κB等炎症细胞因子表达，同时显著上调GluR5（调节神经元突触形成）、NPY（血管生成和重塑因子）及P2Y5（维持毛发生长）的表达。与CZO组相比，Cu-CZO + H₂O₂组皮肤组织中246个基因上调、840个基因下调。KEGG分析显示，神经活性配体-受体信号通路、血管平滑肌信号通路、NOD样受体信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路及坏死和凋亡信号通路均存在显著差异。这些结果提示Cu-CZO + H₂O₂通过下调炎症反应并改善神经修复、血管重塑和毛囊再生来促进皮肤组织的功能再生，网络相互作用图亦获得类似结果。转录组证据共同表明Cu-CZO可通过抑制炎症风暴并改善GluR5、NPY和P2Y5的表达来促进伤口修复和再生。

图9. 转录组分析显示Cu-CZO抑制炎症反应并促进皮肤功能恢复。a）组织修复示意图；b）参与皮肤组织修复的差异表达基因热图；c–e）差异表达基因的火山图；f和g）下调基因的KEGG富集；h–j）各通路中差异表达基因的网络图。

（10）Cu-CZO的生物安全性评价

良好的生物安全性是纳米材料临床应用的前提，研究团队对Cu-CZO进行了系统评估。CCK-8实验显示，L929细胞经8 μM Cu-CZO处理24小时和48小时后存活率分别大于95%和90%，细胞免疫荧光验证了该结果，表明其体外生物相容性良好。溶血实验证明即使高浓度（8 μM）下溶血率仍小于5%，具有高血液相容性。主要器官组织学分析显示各组均未出现明显病理变化，常规血液检测中血细胞比容、白细胞、红细胞及血红蛋白均无显著差异，AST、ALT、BUN和CRE等生化指标亦未发生显著变化。ICP-MS检测显示Cu-CZO处理后仅在心脏和肝脏中检测到铜，且浓度在正常生理范围内，未引起全身性异常铜积累。上述结果共同支持Cu-CZO优异的生物相容性和安全性，表明其具有良好的转化和临床应用潜力。