针对上述问题，广州医科大学徐益鸣团队系统阐明了DAPK2作为OSS敏感内皮激酶，通过磷酸化PKM2 Thr45位点驱动二聚化与核转位，进而激活STAT1依赖性VCAM-1/ICAM-1转录，放大内皮炎症并促进动脉粥样硬化斑块形成的完整分子机制。研究同时证实，内皮特异性Dapk2敲除、PKM2T45A磷酸化缺陷突变体过表达及小分子抑制剂DAPK-IN-2均可显著减轻急性和慢性模型中的斑块负荷，且不影响血脂水平，为动脉粥样硬化的靶向干预提供了新策略。该文章于2026年1月30日以《DAPK2 Regulates PKM2 Phosphorylation at Threonine 45 to Facilitate Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis》为题发表于《Circulation》（DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.125.075951）。

（1）OSS在体内外均显著诱导内皮细胞DAPK2表达

通过重分析小鼠颈动脉内皮特异性RNA微阵列数据（GSE20741），Dapk2在湍流暴露的左颈动脉（LCA）中显著上调，而层流保护基因Klf2则显著下调（图1A）。人主动脉内皮细胞（HAECs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的RNA-seq数据（GSE160611、GSE103672）进一步证实，OSS处理后DAPK2表达显著升高，且远超其他Dapk家族成员（图1B）。体外qPCR显示，HUVECs在OSS条件下DAPK2 mRNA于3小时即显著升高，持续至24小时（图1C），Western blot证实蛋白水平在12小时显著上调（图1D）。在Apoe-/-小鼠中，主动脉弓（湍流区）的Dapk2、Vcam1和Icam1水平显著高于降主动脉（层流区）（图1E）；免疫荧光显示主动脉弓小弯处内皮Dapk2和Vcam1表达显著高于降主动脉（图1F）。C57BL/6小鼠主动脉弓分区分析显示，OSS暴露的小弯和分支区域Dapk2表达显著高于层流的大弯区域（图1G）。部分颈动脉结扎模型（图1H）建立后，超声证实结扎后LCA出现舒张期反向血流（图1I）。术后2周，LCA内皮Dapk2和Vcam1表达显著高于未结扎的右颈动脉（RCA）（图1J），免疫组化显示Dapk2在LCA内皮层显著上调（图1K）。人颈动脉标本分析证实，病变内膜的DAPK2表达显著高于无病变血管（图1L）。

图1. 促动脉粥样硬化性紊乱血流诱导内皮细胞DAPK2表达。A-B，公共数据集显示紊乱血流区域及OSS暴露内皮细胞中DAPK2显著上调（GSE20741、GSE160611）。C-D，HUVECs在OSS条件下DAPK2 mRNA和蛋白呈时间依赖性升高（n=3-6）。E-F，Apoe-/-小鼠主动脉弓（紊乱血流区）Vcam1、Icam1和Dapk2蛋白及内皮表达显著高于降主动脉（n=8）。G，C57BL/6小鼠主动脉弓不同血流区域IF显示Dapk2在振荡剪切区（区域2、3）高表达。H-I，部分结扎LCA模型示意图及超声验证反向血流。J-K，术后2周LCA内皮Dapk2表达及免疫组化显著高于RCA（n=8-5）。L，人颈动脉标本显示病变内膜DAPK2表达显著高于无病变血管（n=6）。

（2）抗动脉粥样硬化药物通过KLF2介导的转录抑制下调DAPK2表达

为阐明DAPK2上调的上游调控机制，团队在HUVECs中过表达多种血流敏感转录因子，发现KLF2和FOXP1显著抑制DAPK2 mRNA表达，而YAP1S127A显著增强其表达，其中KLF2抑制作用最强（图2A）。KLF2敲低显著升高DAPK2 mRNA（图2B），蛋白水平亦相应变化（图2C、2D）。层流剪切应力（LSS）下调DAPK2表达，该效应被KLF2敲低部分逆转（图2E）；相反，OSS诱导的DAPK2上调被KLF2过表达显著减弱（图2F）。生物信息学分析在DAPK2启动子鉴定出3个潜在KLF2结合位点（KBS；CA/GCCC基序），分别位于-381/-370 bp（KBS1）、-577/-566 bp（KBS2）和-758/-747 bp（KBS3）（图2G）。ChIP实验证实KLF2特异性结合KBS1，而非KBS2、KBS3或对照转录因子NUR77（图2H）。荧光素酶报告实验显示，KLF2过表达显著降低DAPK2启动子活性，而删除KBS1后该抑制效应消失（图2I），表明KLF2直接转录抑制DAPK2。鉴于他汀类药物和白藜芦醇（RSV）可上调KLF2，团队检测了其对DAPK2的影响。辛伐他汀（SMV）、瑞舒伐他汀（RES）和RSV均显著下调DAPK2 mRNA（图2J）并抑制启动子活性（图2K）；KLF2敲低则完全 abolish 这些药物的抑制效应（图2L），证实KLF2是介导抗动脉粥样硬化药物抑制DAPK2的关键因子。

图2. 抗动脉粥样硬化药物通过KLF2抑制DAPK2表达。A，筛选显示KLF2过表达显著下调DAPK2 mRNA（n=6）。B-D，敲低KLF2上调DAPK2，过表达KLF2则下调DAPK2的mRNA和蛋白（n=6）。E-F，LSS诱导KLF2并抑制DAPK2，KLF2过表达阻断OSS诱导的DAPK2上调（n=6）。G，人DAPK2启动子含3个KLF2结合位点（KBS1-3）。H，ChIP证实KLF2募集于DAPK2启动子（n=4）。I，荧光素酶报告证实KLF2通过KBS1抑制DAPK2启动子活性（n=6）。J，辛伐他汀、瑞舒伐他汀和白藜芦醇均上调KLF2并下调DAPK2 mRNA（n=6）。K，上述药物抑制DAPK2启动子活性（n=5）。L，敲低KLF2后药物对DAPK2的抑制作用减弱（n=5）。

（3）DAPK2介导OSS诱导的内皮激活，其促炎功能依赖激酶活性

DAPK2敲低未引起其他Dapk家族成员的代偿性改变，但显著降低静态和OSS条件下VCAM-1和ICAM-1的表达（图3A、3B）。相反，DAPK2过表达升高静态ECs中VCAM-1和ICAM-1水平，并进一步放大OSS诱导效应（图3C、3D）。DAPK2敲低的人颈动脉内皮细胞（HCAECs）同样表现出黏附分子表达减弱。RNA-seq分析显示，DAPK2过表达调控流体剪切应力响应、炎症相关生物学过程，并激活NF-κB和TNFα信号通路（图3E-3I）。单核细胞-内皮黏附实验表明，DAPK2敲低显著减少静态和OSS条件下的单核细胞黏附，而过表达则增强黏附（图3J、3K），强化其促动脉粥样硬化作用。

为验证激酶活性的必要性，团队使用腺病毒转导野生型DAPK2（DAPK2WT）、显性负性激酶死亡突变体（DAPK2K52A）和组成性激活突变体（DAPK2CA，缺失CaM结合域）。OSS刺激显著增加DAPK2WT表达ECs中VCAM-1和ICAM-1的mRNA及蛋白水平；DAPK2K52A表达细胞中这些黏附分子诱导显著减弱，而DAPK2CA表达细胞则表现 exaggerated 响应（图3L-3O），证实DAPK2的促炎效应严格依赖其激酶活性。

图3. DAPK2介导OSS诱导的体外内皮激活。A-B，敲低DAPK2抑制OSS诱导的VCAM1和ICAM1蛋白及mRNA上调（n=5-4）。C-D，过表达DAPK2促进VCAM1和ICAM1表达（n=5-6）。E-I，转录组分析显示DAPK2过表达显著改变基因表达谱，GO和KEGG富集于炎症及免疫相关通路，GSEA证实促炎通路激活。J-K，敲低DAPK2减少单核细胞黏附，过表达则增加黏附（n=5）。L-M，激酶失活突变体DAPK2K52A阻断OSS诱导的VCAM1和ICAM1上调（n=5-6）。N-O，组成型活性突变体DAPK2CA在静态条件下即诱导VCAM1和ICAM1表达（n=5-6）。

（4）DAPK2缺乏在急性和慢性模型中均减轻动脉粥样硬化斑块形成

通过构建内皮特异性Dapk2敲除小鼠（Dapk2f/f Cdh5-CreERT2，Dapk2iECKO）及其同窝对照（Dapk2f/f；Dapk2WT），分离的鼠主动脉内皮细胞（MAECs）显示Dapk2iECKO小鼠Dapk2表达显著降低。OSS诱导的Vcam1和Icam1上调在Dapk2iECKO MAECs中显著减弱（图4A）。体内部分颈动脉结扎实验显示，Dapk2iECKO小鼠LCA中OSS诱导的Vcam1和Icam1表达显著低于对照（图4B）。在急性模型中，Dapk2WT/Apoe-/-和Dapk2iECKO/Apoe-/-小鼠于8周龄行部分颈动脉结扎并立即给予西方饮食（WD）4周（图4C）。术后2周，Dapk2iECKO/Apoe-/-小鼠LCA内皮Dapk2和Vcam1表达显著降低（图4D）。4周后，大体形态分析显示Dapk2iECKO/Apoe-/-小鼠斑块面积较对照减少约56%（图4E）；Oil Red O（ORO）和H&E染色证实脂质富集病变形成和内膜增厚显著减少（图4F）。在慢性WD诱导模型中，Dapk2iECKO/Apoe-/-小鼠经他莫昔芬处理后喂WD 3个月，全主动脉和主动脉根部的斑块负荷均显著降低（图4G、4H），且体重和血脂谱（总胆固醇、LDL、HDL、甘油三酯）无显著差异。在Dapk2iECKO/Apoe-/-小鼠部分结扎LCA中局部递送编码FLAG标记WT DAPK2（Ad-FLAG-Dapk2WT）、激酶死亡突变体（Ad-FLAG-Dapk2K52A）或对照载体（Ad-FLAG-Ctrl）的腺病毒（图4I）。Ad-FLAG-Dapk2WT显著升高LCA内皮VCAM-1表达并加剧脂质沉积和内膜增厚，而Ad-FLAG-Dapk2K52A无此效应（图4J-4L）。

图4. DAPK2在急性和慢性动脉粥样硬化模型中促进内皮激活和斑块形成。A-B，Dapk2iECKO MAECs中OSS诱导的Vcam1、Icam1表达显著降低，术后2天LCA内皮Vcam1和Icam1 mRNA下调（n=5-4）。C，急性模型实验设计：6周龄他莫昔芬诱导，8周龄部分颈动脉结扎，WD喂养4周。D，Dapk2iECKO小鼠LCA内皮Vcam1 IF显著降低（n=8）。E-F，Dapk2iECKO减少术后4周动脉粥样硬化病变面积及ORO染色脂质沉积（n=10）。G-H，慢性模型（WD 3个月）中Dapk2iECKO全主动脉及主动脉窦斑块面积显著减少（n=12）。I，挽救实验设计：结扎后注射Ad-Dapk2WT或Ad-Dapk2K52A。J，Ad-Dapk2WT恢复Vcam1表达，Ad-Dapk2K52A无此效应（n=8）。K-L，Ad-Dapk2WT增加病变面积，Ad-Dapk2K52A无显著影响（n=7）。

（5）DAPK2促进PKM2核转位，磷酸化Thr45位点驱动二聚化

通过免疫沉淀-质谱分析（IP-MS）在DAPK2过表达HUVECs中鉴定出83个DAPK2特异性互作蛋白，PKM2在肽段丰度中排名第三（图5A）。主动脉弓内皮面染色显示，小弯处PKM2核定位显著高于降主动脉（图5B）。Co-IP、GST pulldown和邻近连接实验（PLA）证实DAPK2与PKM2存在物理相互作用（图5C-5E）；组成性激活DAPK2CA与PKM2的相互作用强于DAPK2WT。DAPK2不与PKM1互作。OSS显著增加PKM2核定位（图5F、5G）；Y型流体腔室实验显示，非均匀剪切应力分支区域PKM2核定位显著高于均匀应力区域。活细胞成像显示，OSS启动后15分钟即出现PKM2向核内转移（图5H）。DAPK2敲低显著减弱OSS诱导的PKM2核积累（图5I、5J），而过表达则增加静态条件下核PKM2水平。DAPK2CA进一步放大核PKM2，激酶失活DAPK2K52A则抑制之。凝胶过滤分析显示，DAPK2过表达和OSS刺激均诱导PKM2向低分子量物种（二聚体/单体构象）显著转变（图5K）；戊二醛交联实验独立验证四聚体PKM2减少而二聚体/单体富集（图5L）。KPNA1（Importin α5）介导二聚体/单体PKM2核输入；DAPK2WT而非DAPK2K52A增强PKM2-KPNA1互作（图5M），KPNA1敲低 abolish DAPK2诱导的PKM2核转位（图5N）。PKM2四聚体激活剂TP-1454有效抑制OSS诱导的PKM2核定位，并显著减弱DAPK2或OSS驱动的VCAM-1和ICAM-1上调（图5O-5R）。

图5. DAPK2通过调控PKM2寡聚化和核转位促进OSS驱动的内皮激活。A-D，IP-质谱、Co-IP和GST pulldown证实DAPK2与PKM2直接互作。E，PLA显示OSS增强DAPK2-PKM2互作（n=25）。F-G，OSS促进PKM2核转位，分级分离和IF证实（n=4-5）。H，活细胞成像实时追踪OSS诱导的GFP-PKM2核定位。I-J，敲低DAPK2阻断OSS诱导的PKM2核转位（n=4-5）。K-L，凝胶过滤和戊二醛交联显示DAPK2过表达促进PKM2二聚体形成（n=5）。M，Co-IP证实DAPK2激酶活性促进PKM2与KPNA1互作（n=3）。N，KPNA1敲低阻断DAPK2过表达诱导的PKM2核转位（n=4）。O-R，PKM2二聚化抑制剂TP-1454显著抑制OSS或DAPK2过表达诱导的VCAM1和ICAM1上调（n=5-6）。

（6）DAPK2直接磷酸化PKM2 Thr45位点，该修饰在病变内皮中显著升高

PKM2的寡聚状态和核定位受磷酸化等翻译后修饰紧密调控。从对照、DAPK2WT过表达和激酶失活DAPK2K52A过表达HUVECs中免疫沉淀PKM2，用磷酸化Ser/Thr抗体检测，发现DAPK2WT显著增加PKM2磷酸化，而DAPK2K52A无效应（图6A）。体外激酶实验证实DAPK2直接磷酸化PKM2（图6B）。无标记质谱鉴定出高度保守的Thr45位点为磷酸化位点（图6C）。分子对接显示PKM2Thr45与DAPK2催化环强烈互作，对接评分-148.2（图6D）。体外激酶实验进一步验证，DAPK2 robustly 磷酸化WT PKM2，但不磷酸化Thr45突变为丙氨酸的PKM2T45A突变体（图6E）。OSS显著增加p-PKM2T45水平，该效应被DAPK2敲低 abolish（图6F、6G）。DAPK2WT过表达以剂量依赖方式增强p-PKM2T45，而DAPK2K52A无效应（图6H、6I）。体内实验中，主动脉弓小弯处p-Pkm2T45水平显著高于降主动脉，且Dapk2敲除显著减弱该升高（图6J）。部分结扎LCA诱导Dapk2WT/Apoe-/-小鼠LCA内皮p-Pkm2T45积累，而Dapk2iECKO/Apoe-/-小鼠无此现象。人动脉粥样硬化颈动脉病变内膜中p-PKM2T45水平显著高于无病变组织（图6K）。PKM2T45E（磷酸化模拟突变体）过表达促进PKM2从四聚体向二聚体/单体转变，而PKM2T45A（非磷酸化突变体）无法诱导该构象变化（图6L、6M）。PKM2T45E增加核PKM2水平，PKM2T45A则减少核积累（图6N）。PKM2T45E表达ECs中VCAM-1和ICAM-1水平升高，而PKM2T45A显著减弱OSS诱导的VCAM-1和ICAM-1上调（图6O）。

图6. DAPK2通过磷酸化PKM2 Thr45促进OSS诱导的EC激活。A-B，Co-IP和体外激酶实验证实DAPK2激酶活性促进PKM2磷酸化（n=4）。C，LC/MS鉴定PKM2磷酸化位点为Thr45。D，蛋白对接分析显示DAPK2与PKM2互作界面（对接评分-148.202）。E，体外激酶实验证实PKM2T45A突变阻断DAPK2介导的磷酸化（n=3）。F-I，OSS诱导p-PKM2T45升高，DAPK2敲低降低该磷酸化，过表达DAPK2WT而非K52A增强p-PKM2T45（n=5）。J，Dapk2iECKO小鼠主动脉弓LC段p-Pkm2T45显著降低（n=6）。K，人动脉粥样硬化病变内膜p-PKM2T45显著高于无病变对照（n=6）。L-N，PKM2T45E（模拟磷酸化）促进二聚体形成和核转位，PKM2T45A（非磷酸化）则抑制（n=3-5）。O，PKM2T45A显著减弱OSS诱导的VCAM1和ICAM1上调（n=6）。

（7）PKM2T45磷酸化通过激活STAT1驱动VCAM-1和ICAM-1转录

转录因子富集分析显示，STAT1是DAPK2过表达HUVECs中 top enriched TF（图7A）。OSS刺激诱导STAT1 Tyr701磷酸化（p-STAT1Y701）（图7B、7C）。该响应被DAPK2敲低显著减弱，DAPK2WT过表达增加p-STAT1Y701水平，DAPK2K52A表达细胞中OSS诱导的STAT1磷酸化较DAPK2WT表达细胞降低（图7D）。体内，主动脉弓小弯处p-Stat1Y701水平显著高于DTA，且Dapk2敲除 abolish 该升高（图7E）。Dapk2缺乏亦显著降低部分结扎LCA内皮中p-Stat1Y701水平。DAPK2过表达ECs经TP-1454处理，减弱DAPK2诱导的p-STAT1Y701增加。OSS刺激显著增加PKM2WT过表达ECs中STAT1磷酸化，但PKM2T45A表达细胞中无此效应。荧光素酶报告实验使用含3个STAT1反应元件（SREs）的pSRE-RLuc质粒，DAPK2与PKM2WT共表达显著增强报告活性，而PKM2T45A abolish 该效应（图7F）。VCAM-1和ICAM-1启动子区域各鉴定出2个SREs（图7G）。原位PLA实验显示OSS诱导ECs核内STAT1-PKM2互作，该互作被DAPK2敲低 abolish。ChIP分析显示DAPK2过表达HUVECs中STAT1和PKM2在VCAM-1启动子（-256/-245 bp）和ICAM-1启动子（-77/-66 bp）均富集（图7H）。序贯re-ChIP实验确认STAT1和PKM2在这些位点共占据（图7I）。双荧光素酶实验显示，DAPK2过表达增加PKM2WT表达细胞中VCAM-1和ICAM-1启动子活性，但PKM2T45A表达细胞中无此效应（图7J）。删除SREs（VCAM-1 -256/-245 bp和ICAM-1 -77/-66 bp）abolish DAPK2诱导的启动子激活。

图7. STAT1激活是DAPK2介导PKM2磷酸化诱导VCAM-1和ICAM-1上调所必需的。A，TRRUST预测STAT1为DAPK2-OE差异基因的潜在调控转录因子。B-C，OSS诱导p-STAT1Y701升高及核定位（n=5-6）。D，DAPK2K52A阻断OSS诱导的p-STAT1Y701（n=5）。E，Dapk2iECKO小鼠主动脉弓LC段p-Stat1Y701显著降低（n=6）。F，荧光素酶报告证实DAPK2与PKM2WT共表达激活STAT1，PKM2T45A则阻断（n=6）。G，人VCAM1和ICAM1启动子含2个预测STAT1反应元件（SRE）。H-I，ChIP和ChIP-reChIP证实DAPK2过表达促进PKM2和STAT1在VCAM1、ICAM1启动子募集（n=3）。J，PKM2T45A显著减弱DAPK2过表达诱导的VCAM1和ICAM1启动子活性（n=5）。

（8）DAPK2小分子抑制剂DAPK-IN-2在急性和慢性模型中均有效抑制动脉粥样硬化

为评估DAPK2抑制的治疗潜力，选择性DAPK2抑制剂DAPK-IN-2经CBDOCK2分子对接分析显示与DAPK2 ATP结合口袋亲和力最高（对接评分-7.4；图8B）。体外激酶实验证实DAPK-IN-2有效抑制DAPK2活性，IC50为5.209±0.819 μM（图8C），且10 μM以下不损害EC活力（图8D）。10 μM DAPK-IN-2显著减弱OSS诱导的VCAM-1和ICAM-1表达，并降低PKM2T45和STAT1Y701磷酸化（图8E-8G）。体内急性模型中，Apoe-/-小鼠部分颈动脉结扎后隔日给予DAPK-IN-2（10或20 mg/kg）或对照载体，喂WD 2或4周（图8H）。DAPK-IN-2显著降低Vcam1表达（图8I）、大体斑块面积（图8J）、脂质沉积（图8K）和内膜增厚，且不影响体重和血脂谱。DAPK-IN-2给予Dapk2iEC-KO/Apoe-/-小鼠时，其抗动脉粥样硬化效力显著减弱，病变形成保护作用降低，且抑制OSS诱导Vcam1上调的能力几乎完全丧失。慢性模型中，Apoe-/-小鼠喂WD 2个月期间给予DAPK-IN-2（20 mg/kg隔日一次），显著降低主动脉弓和根部脂质富集病变面积，且不改变血清脂质谱（图8L、8M）。

图8. DAPK2的药理学抑制减轻OSS诱导的内皮炎症和动脉粥样硬化。A-C，DAPK-IN-2化学结构、分子对接（对接评分-7.4）及ADP-Glo激酶抑制实验（IC50：5.209±0.819 μM）。D，DAPK-IN-2在测试浓度和时间范围内无显著细胞毒性。E，DAPK-IN-2（5-10 μM）剂量依赖性抑制OSS诱导的VCAM1和ICAM1蛋白表达（n=5）。F-G，DAPK-IN-2（10 μM）阻断OSS诱导的p-STAT1Y701和p-PKM2T45升高（n=5）。H，急性模型实验设计：8周龄Apoe-/-小鼠部分颈动脉结扎，隔日腹腔注射DAPK-IN-2（10或20 mg/kg），WD喂养4周。I，DAPK-IN-2降低术后2周LCA内皮Vcam1表达（n=6）。J-K，DAPK-IN-2减少术后4周动脉粥样硬化病变面积及ORO染色脂质沉积（n=6）。L-M，慢性模型（2个月WD）中DAPK-IN-2显著减少全主动脉及主动脉窦斑块面积（n=9）。