针对上述问题，北京工业大学苏东东团队联合湖南大学袁林团队及扬州大学、河北大学附属医院神经外科合作，设计开发了ANG-hCy-MC级联识别可激活探针。该探针整合：（1）Angiopep-2（ANG）基序介导LRP1转胞吞跨越BBB并进入GBM细胞；（2）串联酶响应底物实现Cat B与MAO顺序激活，形成级联"双锁"机制确保肿瘤限制性荧光激活；（3）近红外（NIR）荧光团实现深组织成像。该探针通过顺序两步酶级联（Cat B初始切割后MAO触发脱烷基化）将荧光开启严格限制于共表达两种酶的肿瘤微环境，显著降低脱靶信号，实现GBM边缘的精确界定。该文章于2026年2月10日以《A Cascade Recognition of Activatable Probe for Fluorescence Navigation Glioblastoma Surgery:Overcoming Blood-Brain Barrier and Off-Target Limitations》为题发表于《Advanced Science》（DOI：10.1002/advs.202521404）。

方案1 ANG-hCy-MC级联激活设计策略及GBM检测生物医学应用。（A）ANG-hCy-MC的化学结构及级联激活机制。（B）1）穿透血脑屏障及激活过程示意图。2）荧光导航手术切除。（C）人GBM组织切片中侵袭性边缘的界定。

（1）ANG-hCy-MC的理性设计与合成

探针以半花菁荧光团（hCy-OH）为骨架，通过亲核取代反应连接MAO响应底物（叔丁基N-(3-溴丙基)氨基甲酸酯），经脱保护得到中间体hCy-M；随后通过酰胺缩合引入Cat B可切割底物（Boc-Val-Cit-OH），最终脱保护获得核心荧光单元hCy-MC。ANG肽通过铜催化叠氮-炔环加成反应（CuAAC）偶联，得到终产物ANG-hCy-MC。为系统评估靶向特异性与级联激活行为，同步合成了单酶响应对照探针ANG-hCy-M（仅MAO激活）及非靶向对照探针PEG-hCy-MC（无LRP1亲和力）。紫外-可见吸收光谱显示ANG-hCy-MC在~250 nm处吸收显著增强，证实ANG肽成功偶联；Zeta电位分析进一步验证了靶向肽的连接。关键化合物经高分辨质谱（HRMS）及核磁共振（¹H NMR、¹³C NMR）确证结构。

（2）ANG-hCy-MC级联酶激活的光谱学验证

为验证探针的双酶级联响应机制，系统考察了不同酶条件下的光化学性质。仅在Cat B与MAO同时存在时，ANG-hCy-MC才表现出吸收强度显著增加（~650 nm）及708 nm处强荧光开启，确认顺序双酶级联对荧光激活的必要性。单酶处理几乎无信号变化，凸显协同酶切的关键作用。荧光强度与双酶浓度呈线性关系（y=256.8x+11300.5, R²=0.997），具备酶活性定量检测潜力。探针对目标酶显示出高度特异性，生物相关干扰物质均无法触发显著荧光信号。此外，ANG-hCy-MC及其激活产物在连续激发下荧光信号稳定，光稳定性优异（图1）。

图1. ANG-hCy-MC的体外表征。(A) 串联酶激活机制示意图；(B) ANG-hCy-MC（10 μM）在四种条件下的紫外-可见吸收光谱：单独探针、+MAO、+Cat B、+Cat B+MAO，于PBS（10×, pH 7.4）及EDTA（1 mM）中37°C孵育10 h；(C) 对应条件下的荧光发射光谱（λex/em=680/708 nm）；(D) 不同浓度Cat B（0-60 U/L）与MAO（0-60 mg/L）存在下ANG-hCy-MC的浓度依赖性荧光响应；(E) 低酶浓度范围内的线性校准曲线：Cat B（0-26 U/L）与MAO（0-26 mg/L）；(F) 选择性评估：ANG-hCy-MC与生物相关分析物孵育后的708 nm处荧光强度。

（3）hCy-MC双酶级联激活机制的验证

通过光谱、HPLC及HRMS全面阐明了hCy-MC的顺序激活过程。仅在Cat B与MAO共孵育时，hCy-MC才出现680 nm处荧光显著放大。HPLC分析显示：Cat B单独处理生成中间体hCy-M（保留时间7.8 min, m/z=493.2847 [M]⁺）；MAO单独处理不改变hCy-MC保留时间，证实Cat B可切割片段作为"门卫"防止MAO过早激活；双酶顺序处理产生新色谱峰对应终产物hCy-OH（保留时间9.7 min, m/z=436.2268 [M]⁺）。HRMS进一步确认了各步转化产物的精确分子量。多维度证据确立了级联激活机制：Cat B水解酰胺键后，MAO介导氧化脱胺释放荧光团hCy-OH，该门控策略最小化脱靶激活，为高保真分子成像奠定基础（图2）。

图2. hCy-MC级联激活机制的体外验证。(A) hCy-MC针对Cat B与MAO顺序激活的示意图；(B) hCy-MC（10 μM）在四种条件下的紫外-可见吸收光谱：单独hCy-MC、+MAO、+Cat B、+MAO+Cat B；(C) 对应条件下的荧光发射光谱（λex/em=660/680 nm）；(D) 验证hCy-MC响应机制的色谱图；(E) HRMS验证：hCy-MC（精确质量749.4385）、hCy-MC+Cat B生成hCy-M（m/z=493.2847）、hCy-MC+MAO+Cat B生成hCy-OH（m/z=436.2268）。

（4）ANG-hCy-MC对GBM细胞的高特异性成像

GL261及U87胶质瘤细胞系（确认表达Cat B与MAO）用于评估靶向摄取与级联激活。CCK-8实验显示ANG-hCy-MC在测试浓度范围内细胞存活率>90%，生物相容性良好；共聚焦成像显示其经LRP1介导内化并在胞内激活荧光。CA-074（Cat B抑制剂）或氯吉灵（CL，MAO抑制剂）预处理均使荧光信号显著降低（p<0.001），双酶共激活的必要性及荧光强度与酶活性的线性相关性得以验证。以低Cat B/MAO活性的CTX TNA2星形胶质细胞为正常对照，ANG-hCy-MC的GL261/CTX TNA2荧光强度比显著高于单锁探针ANG-hCy-M（p<0.001），双酶级联策略通过要求Cat B与MAO共表达有效抑制脱靶激活；U87细胞中观察到一致趋势，证实该探针在不同GBM亚型中的特异性识别稳健性（图3）。

图3. ANG-hCy-MC在GL261 GBM细胞中的细胞荧光成像及体外BBB穿透评估。(A) 探针在GBM细胞中的激活示意图；(B) 酶抑制条件下GL261细胞与ANG-hCy-MC（10 μM）孵育的共聚焦成像：(a)未处理对照；(b)Cat B抑制剂CA-074（100 μM, 2 h）预处理；(c)MAO抑制剂氯吉灵（CL, 100 μM, 2 h）预处理；(d)CA-074+CL联合处理；(C) GL261（胶质瘤）与CTX TNA2（正常）星形胶质细胞的对比成像；(D) (B)中荧光强度的定量分析；(E) (C)中GL261与CTX TNA2细胞的荧光强度比值（F_GL261/F_CTX TNA2）；(F) 基于Transwell的体外BBB模型示意图；(G) 下室GL261细胞的代表性CLSM图像：(i)空白对照；(ii)PEG-hCy-MC处理组；(iii)ANG-hCy-MC处理组；(H) (G)中GL261细胞荧光强度的定量分析。

（5）体外BBB模型验证ANG-hCy-MC的穿透能力

采用Transwell体外BBB模型评估ANG介导的主动BBB穿越能力。在上室接种bEnd.3细胞形成模拟BBB的单层，下室接种GL261细胞。ZO-1免疫荧光染色证实内皮屏障的完整性与功能性。非靶向探针PEG-hCy-MC保留双酶级联激活特性，作为适当对照。孵育48 h后，ANG-hCy-MC有效穿越bEnd.3内皮屏障，在下室GL261细胞内内化并激活红色荧光；而PEG-hCy-MC屏障穿透有限，靶细胞荧光信号微弱。定量分析显示ANG-hCy-MC组荧光强度较PEG-hCy-MC组高3倍以上，证明ANG偶联显著增强BBB通透性，为体内应用奠定实验基础（图3F-H）。

（6）原位GBM小鼠模型中ANG-hCy-MC的体内靶向荧光富集验证

皮下移植瘤模型中，瘤内预注射Cat B抑制剂CA-074或MAO抑制剂CL均较PBS对照组显著降低荧光信号，验证酶依赖性激活机制；未处理组肿瘤部位特异性激活，并经肝肾清除。原位GL261-Luc模型进一步评估脑靶向与激活特异性：静脉注射后1 h，ANG-hCy-MC组GBM区域即出现强荧光，3 h达峰，12 h仍维持显著信号，非肿瘤脑区背景极低；PEG-hCy-MC组肿瘤荧光微弱，3 h时强度较ANG-hCy-MC组低6倍。离体成像显示ANG-hCy-MC的肿瘤/正常脑组织荧光比（T/N）为4倍，显著高于PEG-hCy-MC的1.7倍。主要脏器H&E染色未见异常，生物安全性良好（图4）。

图4. 原位GL261 GBM小鼠模型中ANG-hCy-MC的体内靶向荧光富集验证。(A) 肿瘤种植与成像时间线的实验示意图；(B) 荷瘤小鼠的体内荧光成像：(a)ANG-hCy-MC组；(b)PEG-hCy-MC组；(C) (B)中体内肿瘤荧光强度的定量分析（***p<0.001）；(D) 给药12 h后离体器官的荧光图像：(a)ANG-hCy-MC组；(b)PEG-hCy-MC组；(E) (D)中离体器官荧光强度的定量分析；(F) 显示肿瘤-正常对比的代表性脑图像：(i)ANG-hCy-MC组；(ii)PEG-hCy-MC组（红色虚线：肿瘤区域）；(G) (F)中肿瘤-正常脑组织荧光比的定量分析。

（7）GBM的荧光导航手术切除与细胞级边界界定

ANG-hCy-MC的肿瘤靶向能力与成像对比度在荧光导航手术切除中得以验证：探针注射12 h后，NIR荧光引导下肿瘤切除，生物发光与荧光信号共定位确认靶向精确性；切除后部位荧光信号大幅减弱，后续生物发光成像验证肿瘤完全切除。离体组织切片评估显示，原位小鼠GBM模型冰冻切片（5 μm）中H&E染色确认肿瘤边界，ANG-hCy-MC荧光在病理边界处急剧下降，低倍下即可清晰判别；与单锁探针ANG-hCy-M相比，ANG-hCy-MC荧光与肿瘤边缘紧密对齐，邻近正常组织信号极小，F_T/F_N比值较ANG-hCy-M高约1.5倍，最大T/N比达11.61倍，10倍放大下仍维持10.45倍（图5）。

图5. 原位GBM模型中的荧光导航肿瘤切除及细胞级边缘界定。(A) 荧光导航肿瘤切除及原位模型边缘评估流程示意图；(B) 肿瘤切除前后的术中生物发光与荧光图像（红色虚线区域：GBM及切除区域）；(C) 确认肿瘤完全切除的离体脑图像（λex/em=680/710 nm）；(D) 小鼠GBM边缘分析：H&E染色及对应ANG-hCy-MC荧光（10 μM, 30 min）的(a,c)低倍与(b,d)高倍图像，比例尺：(a,c) 1 mm；(b,d) 100 μm，虚线指示肿瘤边缘；(E) (D(a,b))中肿瘤与邻近正常区域荧光强度的定量分析；(F) (D(c,d))中肿瘤与邻近正常区域荧光强度的定量分析。

（8）人GBM标本中侵袭边缘的细胞级精准界定

ANG-hCy-MC在临床人GBM组织切片中的细胞级边界界定性能得到验证：H&E染色显示肿瘤呈侵袭性生长、边界不清，荧光共聚焦显微镜显示ANG-hCy-MC强烈标记肿瘤区域并与组织病理学特征高度一致，肿瘤边缘荧光强度较正常实质显著升高（***p<0.001），3D Z-stack重建确认荧光局限于恶性区域，穿透深度约40 μm。浸润区共定位评估显示，ANG-hCy-MC准确勾勒侵袭边缘及分散肿瘤细胞，荧光强度在过渡至正常组织时急剧下降，10倍放大下T/N比仍达7.83倍，荧光界定边界与H&E染色病理边界高度一致，单细胞分辨率下侵袭前沿精确识别得以实现（图6）。

图6. 利用ANG-hCy-MC精准界定人GBM标本中的侵袭边缘。(A) 临床GBM标本处理流程；(B) 人GBM边缘验证：H&E染色界定的组织结构与ANG-hCy-MC荧光的共定位（比例尺：100 μm）；(C) (B)中肿瘤灶与正常实质的荧光强度对比；(D) ANG-hCy-MC（10 μM）Z轴扫描确认GBM标本中的3D限制性激活；(E) 临床GBM冰冻切片的边缘分析：H&E染色及对应ANG-hCy-MC荧光（10 μM, 30 min）的(i,ii)低倍与(iii,iv)高倍图像，比例尺：(i,ii) 1 mm；(iii,iv) 100 μm，虚线指示GBM边缘区域；(F) (E(i,ii))中肿瘤与邻近正常区域荧光强度的定量分析；(G) (E(iii,iv))中肿瘤与邻近正常区域荧光强度的定量分析。